多肽合成具體合成由下列幾個循環(huán)組成：
 

　　除去保護Fmoc保護的柱子和單體必須用一種堿性溶劑(piperidine)去除氨基的保護基團。激活和交聯(lián)下一個氨基酸的羧基被一種激活劑所激活。化學工藝常用HBTU/HCTU/HITU/HATU+NMM/DIPEA或HOBT+DIC作激活劑，激活的單體與游離的氨基反應交聯(lián)，形成肽鍵。 在此步驟使用大量的超濃度試劑驅使反應完成。循環(huán)：這兩步反應反復循環(huán)直到合成完成。
 

　　氨基酸縮合結束后，可用適量TFA進行洗脫，根據(jù)起酸堿性，可選擇10%TFA/DCM溶液，至100%TFA，以此類推。(注：此種方法為個人合成經(jīng)驗，并無文獻資料可查;可根據(jù)需要進行參考。 知識有限，望謹慎參考)
 

　　HPLC分析和純化高效液相色譜hplc流程示意分析HPLC使用柱子和泵系統(tǒng)，可以經(jīng)受傳遞高壓，這樣可以用極細的微粒(3-10μm)做填料。由此多肽要在幾分鐘內(nèi)高度被分析。
 

　　HPLC分兩類：離子交換和反相。離子交換HPLC依靠多肽和固相間的直接電荷相互作用。 柱子在一定PH范圍帶有特定電荷衍變成一種離子體，而多肽或多肽混合物，由其氨基酸組成表現(xiàn)出相反電荷。分離是一種電荷相互作用，通過可變PH，離子強度，或兩者洗脫出多肽，通常，先用低離子強度的溶液，以后逐漸加強或一步一步加強，直到多肽火柱中洗脫出。 離子交換分離的一個例子使用強陽離子交換柱。
 

　　如sulfoethylaspartimide通過酸性PH中帶正電來分離。反相HPLC條件與正常層析正相反。多肽通過疏水作用連到柱上，用降低離子強度洗脫，如增加洗脫劑的疏水性。通常柱子由共價吸附到硅上的碳氫烷鏈構成，這種鏈長度為G4-G8碳原子。
 

　　由于洗脫是一種疏水作用。長鏈柱比短鏈對小的，高帶電肽好。另一方面大的疏水肽用短鏈柱洗脫好。然而，總體實踐中，這兩類柱互變無多少顯著差別，別類載體由碳水化合物構成，比如苯基。
 

　　hplc法檢測圖譜典型的操作常由兩綬沖劑組成，0。1%TFA-H2o和80%acetonitrile0。 1%TFA--H2o稀acetonitrile。用線型梯變以每分鐘0。5%到1。0%改變的速度混合。
 

　　常見分析和純化用柱為4。6×250mm(3-10μm)和22×250mm(10μm)。如果用徑向填柱，那么大小是8×100(3-10μm)和25×250mm(10μm)大量各種緩沖劑含許多不同試劑，比如heptafluorobutyric酸，0.1%磷酸，稀Heformic酸(5-6%,pH2-4),10-100mMNH4HCO3,醋酸鈉/氨，TFA/TEA，磷酸鈉或鉀，異戊酚。
 

　　這樣許多不同組合可形成緩沖劑，但要注意一點：硅反相柱料不能長時間暴露于高pH，甚至微堿pH，因為這樣會破壞柱子。
 

　　不要把肽含量和純度搞混了。肽的純度可能是100%，而肽含量相關帶電基團(如Arg,Lys)的抗離子量和肽親水性決定。這是合成肽的本身特性。